El nacimiento de la oveja Dolly causó un gran eco en los medios de comunicación de todo el mundo. Sin embargo, la clonación de esta oveja es fruto de varias décadas de experimentaciones e investigaciones en diversos laboratorios y de una técnica difícil y compleja, como se recoge en este fragmento del artículo ¿Qué tal, Dolly?
Fragmento de ¿Qué tal, Dolly?
De Olivier Postel-Vinay y Annette Millet.
Hacía mucho tiempo que una noticia científica no había tenido tanto eco. Televisiones, periódicos y revistas de todo el mundo, jefes de Estado y parlamentos, científicos e industriales, ecologistas y especialistas en bioética, filósofos y hombres de Iglesia han producido en sólo algunos días una cacofonía inverosímil y duradera.
¡Y todo por el nacimiento de una oveja! ¡Y un experimento todavía no reproducido! ¿Tan impulsiva es la humanidad? ¿O es que hay que admitir que estas reacciones apasionadas son indicio de que se ha producido un acontecimiento fundamental? ¿Que el nacimiento fabricado de un mamífero sin padre —un clon de su madre— tiene un alcance simbólico colosal? ¿Hay que ver en él un hito decisivo en la historia de nuestra especie? ¿O, quizá, puede ser una fractura decisiva entre el mundo científico y el de los simples ciudadanos? Para ayudar a nuestros lectores a contemplar este panorama con más luz, hemos elaborado las bases de este dossier. He aquí, pues, una síntesis objetiva de los principales elementos que permiten, a nuestro juicio, elaborar una opinión sobre este caso. Tanto a nivel científico como técnico, económico o ético.
1. Cómo se ha fabricado Dolly
La relativa simplicidad de los procedimientos descritos y de los esquemas presentados a la prensa no deben dar lugar a ilusiones. La clonación de Dolly es una operación difícil y compleja, resultado de décadas de investigaciones y de experimentaciones en diversos laboratorios. Ha habido muchos fracasos y, también, el desaliento de muchos equipos. Intereses privados estaban en juego. Además, es posible que no se hayan dado a conocer todos los detalles.
He aquí las principales etapas de la operación. En realidad, la mayor parte son un concentrado de una serie de subetapas, cada una de las cuales implica muchas elecciones, por ejemplo, el momento exacto de cada intervención, la composición de unos determinados medios de cultivo, la sucesión de los gestos del experimentador, los instrumentos utilizados... Tal como destacaban, ya en 1990, los autores de una obra de referencia sobre la biología del desarrollo, en materia de clonación, «los detalles de la técnica experimental pueden influir muchísimo en las respuestas a una determinada cuestión».
Los investigadores escoceses también han obtenido corderos a partir de células de un feto de 26 días
Los investigadores escoceses tomaron, por biopsia, células de glándula mamaria de una oveja blanca Finn Dorset de seis años. El animal estaba en el último trimestre de su gestación, momento en que las células mamarias están más diferenciadas y se multiplican. Las células tomadas se cultivaron in vitro y luego se colocaron durante cinco días en un medio de cultivo muy empobrecido en suero, dieta rigurosa cuyo efecto es provocar poco a poco la suspensión completa del ciclo celular (fase G0, «G cero»). Seguidamente, cada una de estas células, en estado de casi hibernación, se introdujeron en un ovocito no fecundado y enucleado de oveja Scottish Blackface (de cabeza negra).
Los ovocitos se obtuvieron quirúrgicamente por perfusión de los oviductos después de una estimulación ovárica. En el momento de la obtención, su ciclo celular quedó en suspenso. Los ovocitos se encuentran naturalmente en esta fase, llamada metafase II, en el momento de la ovulación. A causa de la meiosis, únicamente contienen un solo juego de cromosomas, que forman, en este momento preciso, una placa casi plana, excéntrica, situada no lejos del glóbulo polar, una pequeña bola que contiene otro juego de cromosomas y que está destinada a ser eyectada. Entonces, los experimentadores aspiraron la placa cromosómica, arrastrando de una sola vez el glóbulo polar y una parte del citoplasma. Los ovocitos así enucleados, que habían conservado la mayor parte de su citoplasma, fueron transferidos a un medio de cultivo a 37 ºC. Se «activaron» con la ayuda de un primer impulso eléctrico; luego, y gracias a una serie de nuevos impulsos eléctricos, cada uno de ellos se fusionó con una célula mamaria de la oveja donante. La aplicación de la corriente eléctrica también tenía por objeto facilitar el desarrollo de la nueva célula acabada de formar (un nuevo embrión).
De esta manera se crearon no menos de 277 embriones a finales de enero de 1996. A continuación, fueron colocados en el oviducto ligado de diversas hembras. Después de seis días, 247 fueron recuperados. Veintinueve se habían desarrollado hasta el estado de mórula o de blastocisto y fueron transferidos al útero de 13 ovejas portadoras. Aparentemente, tan sólo un embrión se desarrolló en feto y, posteriormente, en un cordero viable que nació el 5 de julio de 1996, al final de una gestación de duración casi normal y con un peso también normal. Dolly no muestra ningún signo de anomalía. Falta por ver si más tarde se presenta algún problema y si podrá procrear normalmente.
Siguiendo el mismo protocolo experimentado, lan Wilmut, Keith Campbell y sus colegas del Roslin Institute de Midlothian, cerca de Edimburgo, obtuvieron tres corderos a partir de células de un feto de 26 días y otros cuatro corderos procedentes de células de un embrión de 9 días.
2. ¿Cuál es la novedad?
El principio de la enucleación de un ovocito para servir de incubadora a una célula fue ideado por el embriólogo alemán Hans Spemann en vísperas de la segunda guerra mundial. En 1938, propuso lo que él llamó un «experimento fantástico». Se trataba de introducir el núcleo de una célula de embrión de batracio en un ovocito enucleado con el fin de verificar la hipótesis de que cada una de las células de un embrión joven contiene todas las instrucciones para el desarrollo completo de un individuo. En aquella época, todavía no se tenía conocimiento de la doble hélice del DNA. La idea la aplicaron por primera vez con éxito Robert Briggs y Thomas King en 1952, en Filadelfia. Estos investigadores consiguieron disociar, sin estropearlas, las células (blastómeros) del paquete embrionario (en estado de blastocito), tomar los cromosomas de óvulos no fecundados de ranas sin dañarlos demasiado, activarlos como si hubiesen sido fecundados normalmente, y colocar los blastómeros uno a uno en cada óvulo. Obtuvieron renacuajos capaces de nadar. Siguieron otros muchos experimentos con batracios y se consiguieron animales adultos.
La principal aportación técnica del equipo escocés es haber puesto las células embrionarias en estado de hibernación
En cambio, en los mamíferos la operación fue más delicada. Una técnica de transferencia nuclear, puesta a punto en el ratón en 1983, sólo dio unos resultados limitados. El experimento decisivo para comprender de dónde viene Dolly fue obra del embriólogo danés Steen Willadsen, entonces en Cambridge (Gran Bretaña). Utilizando un protocolo ya muy parecido al descrito para Dolly, en 1984 obtuvo carneros adultos en buena salud a partir de embriones de 8 y 16 células colocados en ovocitos no fecundados y enucleados. Uno de los embriones fue congelado durante más de cuatro años.
En los bóvidos, que tienen un mayor interés económico, el debut corrió a cargo del equipo del norteamericano Neil First en 1986. A partir de embriones recogidos in vivo o por FIV (fecundación in vitro), han nacido ya unos 2.000 terneros gracias a esta técnica, sobre todo en Estados Unidos, aunque también en Francia. Asimismo, se han conseguido éxitos en la cabra. En el conejo, el equipo de Jean-Paul Renard e Yvan Heyman, del INRA, obtuvo en 1990 seis gazapos clonados procedentes de un embrión único.
Hasta 1992, los investigadores tuvieron un índice de fracasos muy alto con los mamíferos. Algunas anomalías cromosómicas inducían la suspensión del desarrollo. Muy pronto, el fenómeno se interpretó como una consecuencia de la dificultad, en el momento de la fusión, de sincronizar los ciclos de la célula donante y de la célula receptora (citoplasma enucleado). En la naturaleza, en el momento de la fecundación, las células se hallan manifiestamente en fase. ¿Cómo conseguirlo en laboratorio? Primero, los científicos buscaron los medios de preactivar químicamente o eléctricamente, antes de la fusión, el ovocito enucleado. Un impulso eléctrico induce la liberación de calcio intracelular, lo mismo que lo haría un espermatozoide en el momento de la fecundación. La preactivación del ovocito permite, sobre todo al núcleo de la célula donante, no perder su envoltura nuclear en el momento de la fusión. Este método de preactivación eléctrica se practica habitualmente desde hace dos años en diversos laboratorios.
La principal aportación técnica del equipo escocés es una segunda mejora, que consiste en hacer que, antes de la operación de fusión, las células embrionarias salgan de su ciclo normal de replicación. Como se ha visto, en el experimento Dolly, las células donantes fueron puestas en hibernación. Sobrevivieron en una solución salina que contenía factor de crecimiento en cantidad exacta para dejarlas vivas. Se hallaban «en el límite de la apoptosis (muerte celular)», dijo Louis-Marie Houdebine, investigador del INRA en contacto con el equipo escocés.
Hasta entonces, la mayor parte de las células embrionarias utilizadas para las transferencias nucleares estaban en fase G2 (crecimiento) o S (replicación del DNA), lo que, al producirse la fusión, provocaba una replicación adicional del DNA y una condensación prematura de la cromatina (los cromosomas y las proteínas que lleva asociadas). Generalmente, esto originaba anomalías cromosómicas.
Pero he aquí la gran novedad: los investigadores escoceses se dieron cuenta de que combinando estas dos técnicas —activación del ovocito enucleado y suspensión del ciclo de las células donantes— podían conseguir el nacimiento de animales viables con células muy diferenciadas, y hasta totalmente diferenciadas. La mayor parte de los biólogos pensaban que esto era absolutamente imposible.
Cada célula del organismo lleva todo el material genético del individuo. Durante la diferenciación progresiva que se produce desde las primeras fases del desarrollo embrionario hasta el nacimiento o más allá de él, las células se especializan: sólo una parte de los, aproximadamente, cien mil genes del individuo se expresa en cada célula. El resto de los genes son mudos. Pero ¿qué significa «mudos»? La opinión de que estos genes no están necesariamente perdidos, definitivamente paralizados, en cierta manera muertos, y que sería posible reprogramarlos, ha sido una idea que, durante treinta años —desde comienzos de la década de 1950 hasta comienzos de la de 1980—, alimentaron muchos biólogos, para luego, súbitamente, tacharla de la lista de posibilidades.
Los que experimentaron con éxito en los batracios desde los años 1950, tenían esta idea muy presente. Llevaron a cabo muchos experimentos tomando células de embriones cada vez más desarrollados, e incluso células de animales adultos, para tratar de producir con ellas animales viables. Y lo consiguieron, pero únicamente hasta cierto punto. Células tomadas de renacuajos y del intestino de ranas adultas, colocadas en ovocitos enucleados, produjeron renacuajos. Pero jamás, contrariamente a lo que por un momento pudo creerse, ranas adultas.
En 1984, los biólogos publicaron en Science que «la clonación de los mamíferos por transferencia nuclear es imposible»
A principios de los años 1980, la comunidad científica se dejó convencer por dos investigadores de renombre, Karl Illmensee, de Ginebra, y Peter Hoppe, de Bar Harbor (Maine). En un artículo publicado en la célebre revista Cell, decían que habían conseguido clonar embriones de ratón a partir de células ya diferenciadas de embriones en estado de blastocisto. Pero tres años más tarde, James Grath y Davor Solter, del Wistar Institute, de Filadelfia, que habían puesto a punto una técnica de clonación aparentemente más perfeccionada, escribían en Science que el experimento de Illmensee no era repetible y llegaban a la conclusión de que «la clonación de mamíferos por transferencia nuclear es biológicamente imposible». lllmensee fue acusado de fraude y, ante las dificultades encontradas con el ratón, la mayor parte de los investigadores que habían trabajado en la clonación de mamíferos —también Grath y Solter— abandonaron sus investigaciones.
La antorcha fue recogida discretamente por un puñado de biólogos que trabajaban en las industrias ganadera y de biotecnologías. Así, en 1986, lan Wilmut supo por una indiscreción que el danés Willamsden, que se había incorporado a Grenada Genetics, de Texas, había conseguido, en 1984, el nacimiento de un cordero a partir de células de blastocisto ya diferenciadas. Pero Willamsden no había publicado este resultado y Wilmut se propuso confirmarlo. En 1989, obtuvo un cordero con células de la masa celular interna de blastocisto. En 1991, Keith Campbell empezó a trabajar con Willmut en el Roslin Institute. Fue él quien tuvo la idea de experimentar con células quiescentes, en fase G0. También aquí intervino el azar, y por partida doble. Wilmut lo explicó al New York Times. En 1993, el equipo de Neal First (Wisconsin) produjo cuatro terneros a partir de células de blastocisto ya diferenciadas. ¿Cómo lo consiguieron? Gracias a una indiscreción, Campbell supo que un técnico del laboratorio había olvidado alimentar con suero las células en cultivo... Él y Wilmut decidieron muy pronto aplicar la receta. El resultado no se hizo esperar: en 1995, hicieron nacer corderos a partir de células diferenciadas de blastocisto. Incluso se permitieron el lujo de pasarlas trece veces en cultivo. En esta fase, las células apenas si tienen nada que ver con las células iniciales, ya que su morfología se ha diferenciado mucho. «Es el resultado esencial», dice Yvan Heyman. Uno de los corderos nacidos de este experimento es hoy un oveja gestante.
Sin duda, la propia Dolly también es, en parte, fruto del azar. Un azar provocado, es cierto, pero 277 embriones formados a partir de células de glándula mamaria sólo han dado un animal viable. No es mucho. El experimento deberá ser repetido por otros laboratorios. Actualmente, la mayor parte de los investigadores creen que esto será posible. Pero los medios de comunicación no han destacado suficientemente otro resultado del equipo escocés: la obtención de corderos a partir de células de un feto de 26 días. Este resultado, por sí solo, ya hubiera podido causar sensación, puesto que, en esta fase, un feto ovino es ya un animal completamente diferenciado, con la cabeza y las extremidades, el sistema nervioso y todos los órganos. Es cierto que hoy un mamífero grande puede reproducirse con células normales del cuerpo (llamadas somáticas) y que la aportación de las células sexuales se limita al citoplasma de un ovocito. Pero, a pesar de lo que digan muchos, esto solo ya es bastante novedad.
Fuente: Postel-Vinay, Olivier y Millet, Annette. ¿Qué tal, Dolly? Mundo Científico. Barcelona: RBA Revistas, junio, 1997.
